葉酸缺乏對大鼠同型半胱氨酸水平及動脈損傷的影響

馬雪興  劉王明  王毓明  吾柏銘  李明珍aoweellao

(江蘇省蘇州市第三人民醫院心內科, 江蘇 蘇州  215008)

   血漿同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）濃度增高是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)一個獨立的危險因數[1]。近年發現，心、腦血管病患者血漿Hcy濃度高於健康人，血清和紅細胞葉酸濃度低於健康人[2]。葉酸缺乏可改變Hcy的代謝途徑而引發高Hcy血症。我們於1999年至2000年研究了缺乏葉酸飲食對大鼠血漿水平及主動脈組織的影響及其關係。

材料和方法

一、實驗物件

   健康8周齡Wistar雄性大鼠20只，購自中科院上海實驗動物中心，每只體重160~180 g，隨機分成葉酸缺乏組和對照組，兩組體重無差異。

二、飼養方法和樣本採集

    實驗大鼠檢疫1周後分2組籠養，分別以葉酸缺乏和葉酸正常飼料飼養，自由飲水，12 h交替光照，室溫控制在（22±2）0c，飼養3個月。每月測體重1次，實驗前剪尾采血(斷食7h)，3個月後斷頭采血，部分血樣以2% EDTA‐Na2和肝素抗凝，分別3000r/min離心10 min，取上層血清及血漿，-30oc冰箱保存備用。

   葉酸缺乏飼料購自美國ICN公司，其配比為：無維生素酪蛋白15.0%，無葉酸混和維生素1.0%，鹽混合物1.8%，葡萄糖20.0%，黃油8.0%，鋸木屑10.0%，果糖9.0%，植物素1.2%，向日葵油5.0%，菜籽油7.0%，醫用澱粉22.0%。以上成份充分混合前加入0.5%的磺胺甲基嘧啶以防細菌產生葉酸，加工成塊，40c保存[3]。對照組飼料為葉酸缺乏飼料中加入葉酸750 µg/kg·飼料。

三、觀察指標及檢測方法

1.        血清葉酸濃度：採用放射免疫法（RIA）測定，試劑盒由美國DPC公司研製。

2.        血漿Hcy濃度：採用高壓液相色譜法。使用島津LC‐9A型高效液相色譜儀，反相分析柱（250.0 mm×4.6 mm）為C18，5 µm，螢光檢測儀為島津RF535型，激發波長為385 nm，發射波長為515 nm、流動相為0.1 mol/L磷酸二氫鉀(以正磷酸調至酸鹼度pH為2.1，含10%乙腈),具體方法見文獻[4]。

3.        紅細胞超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活力：採用酶標法，試劑盒購自南京建城生物工程研究所。

4.        血清肝、腎功能：穀丙轉氨酶(ALT)、穀草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌苷(Cr)、尿酸(UA)用日立7060全自動生化分析儀測定。

5.        主動脈組織學改變：大鼠處死後迅速取下主動脈，立即切下主動脈弓上段3-4 mm（作電鏡檢測），餘下段放於10%的福馬林液中固定，經石蠟包埋切片，HE染色後進行光鏡檢測。

四、統計學處理

   各組測定值用（x±s）表示。組內差異的顯著性用配對的t檢驗，組間差異的顯著性用非配對的t檢驗。

結  果

一、血清葉酸及血漿Hcy濃度變化

見表1，葉酸缺乏組實驗前血清葉酸和血漿Hcy濃度與對照組差異無顯著性，實驗後葉酸濃度明顯低於而血漿Hcy濃度明顯高於實驗前和對照組。

  表1 血清葉酸及血漿Hcy濃度實驗前後變化比較（x±s）

   注：與對照組比較，* P<0.001；與實驗前比較，D P<0.001

二、實驗後兩組紅細胞SOD、GPX活力變化 

見表2，實驗後葉酸缺乏組紅細胞SOD和GPX活力分別高於和低於對照組。

               表2  實驗後兩組紅細胞SOD及GPX活力比較 (x±s)

                          注：與對照組比較，* P<0.05  **<0.01

    三、主動脈組織學變化

 見圖1~3，光鏡顯示: 對照組見2只大鼠主動脈內膜出現內皮細胞腫脹，內皮下疏鬆，其餘8只未見異常。葉酸缺乏組大鼠主動脈全部出現散在的內皮細胞腫脹，內皮下水腫、膠原纖維增生，其中7只出現主動脈內皮脫落，內彈力膜皺褶、斷裂，內皮脫落處粘附有血栓及膠原纖維；4只見主動脈中膜增厚、平滑肌細胞瘤樣增生伴內壁潰瘍形成見。

四、實驗後肝、腎功能變化

 見表3，實驗後肝、腎功能，包括AST、ALT、BUN、Cr、UA測值二組間差異無顯著性。

表3  實驗後二組肝、腎功能比較( x±s)

討  論

    本研究結果顯示，葉酸缺乏飼料餵養的大鼠血清葉酸水平比實驗前下降50%以上，血漿Hcy濃度增高近3倍，而對照組則無明顯差異。葉酸缺乏組實驗後血清葉酸和血漿Hcy濃度分別低於和高於對照組，血漿Hcy濃度接近人中度高Hcy血症水平。食物中的蛋氨酸(methionine,Met)在肝臟與腺苷結合成為S‐腺苷蛋氨酸(SAM)，再進一步脫甲基、脫腺苷轉化為Hcy。Hcy一方面經胱硫醚‐β‐合成酶催化生成胱硫醚由腎排出體外，另一方面又能結合甲基再轉化為Met，這一反應中N‐5甲基四氫葉酸為甲基供體，葉酸缺乏將影響Hcy向Met轉化而使SAM減少，SAM不足可抑制胱硫醚‐β‐合成酶，從而影響Hcy向胱硫醚轉化排泄，最終導致Hcy濃度增高。本實驗中大鼠腎功能二組間差異無顯著性，排除了因腎功能不全引起高Hcy 血症的可能性。Durand等[5]曾以葉酸缺乏飼料餵養大鼠6周，血漿Hcy濃度達（28.96±3.28）µmol/L，其結果與本研究一致。

 本實驗發現葉酸缺乏組主動脈內皮細胞腫脹、脫落，血栓形成；內皮下組織疏鬆，內彈力膜皺摺，內皮下出現平滑肌細胞；中膜平滑肌細胞增生。這是 AS的早期表現。高Met飲食引發高Hcy血症和動脈組織損傷[6]及AS已被證實。我們沒有發現典型的動脈粥樣斑塊樣變化，可能與飼養時間較短、未同時予高脂飼料或動物種群等有關。

    高Hcy血症損傷動脈組織機制有：(1)增高機體氧化應激——產生氧自由基、羥自由基 [7]，引發脂質過氧化；(2)抑制內皮細胞的增殖，刺激血管平滑肌細胞（SMC）增生[8]， SMC過度增殖並向內膜下移動，吞噬過氧化脂質，形成AS特徵性的泡沫細胞；(3)增加血小板和巨噬細胞組織因數活性，啟動凝血系統[3]。本研究發現，葉酸缺乏組在血漿Hcy濃度增高的同時，紅細胞SOD活力增高。SOD是氧自由基清除劑，高濃度Hcy使體內氧化應激產物（氧自由基等）增多，故SOD活力增高可能是對體內氧自由基增多的代償。超氧陰離子是GPX的抑制因數[9]，SOD活力代償增加仍沒有完全清除體內過多的超氧陰離子，GPX活力被抑制，這可能是GPX活力降低的原因。Toborek等[10]以高Met飼料餵養新西蘭兔6個月,其紅細胞SOD活力升高，觸酶、GPX活力正常，與本實驗結果類似。

 綜上所述，葉酸缺乏可引發高Hcy血症，並造成主動脈組織損傷，其機制可能是高Hcy血症誘導了體內高氧化應激。

參 考 文 獻

1.Bouskey CJ,Beresford SAA,Omenn GS, et al.A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease:probable benefits of increasing folic acid intakes.JAMA, 1995,274:1049-1057.

2.Robinson K,Arheat K,Refsum H,et al.Low circulating folate and vitamin B6 concentrations: risk factors for stroke,peripheral vascular disease,and coronary artery disease. Circulation,1998, 97:437-443.

3.Durand P,Lussier-Cacan S,Blache D,et al.Acute methionine load-induced hyperhomocysteinemia enhances platelet aggregation,thromboxane biosynthesis,and macrophage-derived tissue factor activity in rats. FASEB J,1997,11:1157-1168.

4.李明珍,王毓明,鄭家駒,等.高壓液相色譜測定人血漿總高半胱氨酸含量.色譜雜誌,1999, 17:310-311.

5.Durand P,Prost M,Blache D,et al.Pro-thrombotic effects of a folic acid deficient diet in rat platelets and macrophages related to elevated homocysteine and decreased n-3 polyunsaturated fatty acids.Atherosclerosis,1996,121:231-243.

6.馬雪興,劉王明,吾柏明,等.高蛋氨酸飼料對血漿同型半胱氨酸水平及動脈損傷的實驗研究.美國中華心血管病雜誌,2000,2:155-158.

7.Lang D,Kredan MB,Moat SJ,et al.Homocysteine-induced inhibition of endothelium -dependent relaxation in rabbit aorta:role for superoxide anions. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20:422-427.

8.Tsai JC,Perrella MA,Yoshizumi M,et al.Promotion of vascular smooth muscle cell grouth by homocysteine:a link to atherosclerosis.Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6369-6373.

9.Blum J, Fridovich I.Inactivation of glutathione peroxidase by superoxide dismutase radical. Arch Biochem Biophys,1985,240:500-512.

10.     Toborek M,kopiecznc-Grzebieniak E,Drozdz M,et al.Increased lipid peroxidation as a mechanism of methionine-induced atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis, 1995,115:217-